В середине мая в вышла статья, в которой ученые из Кембриджа описали процесс синтеза и сборки в живом организме самого большого на сегодняшний день генома — кольцевой хромосомы кишечной палочки . Исследователи не просто создали бактерию с синтетическим геномом, но и изъяли из обращения два кодона, кодирующих аминокислоту серин, получив таким образом организм с сокращенным генетическим кодом. По сравнению с той информационной шумихой, которую создавал Крейг Вентер (пионер исследований генома человека и директор института имени себя) вокруг своих проектов по синтетической геномике (речь идет, в первую очередь, о создании первого организма с синтетическим геномом и бактерии с минимальным геномом), новость о «подмене» хромосомы кишечной палочки прошла практически незаметно. Тем не менее, это важная веха в области синтетической биологии, ведь речь идет о четырех миллионах пар оснований, которые были получены в лаборатории из раствора нуклеотидов и затем попали в живую клетку. Разбираемся, как синтезировать геном в лаборатории, зачем ученые вообще занимаются подобными вещами и что нового произошло в синтетической геномике со времен «первого синтетического живого организма», опубликованного в 2010 году командой Крейга Вентера.
Синтез целых геномов — раздел синтетической биологии, которая ставит своей задачей создание организмов с заданными свойствами при помощи современных методов генной инженерии.
Вообще-то, принципы синтетической биологии давно используются и в области индустриальной микробиологии для создания микробов — сверхпродуцентов ценных молекул, и в экологии (например, для создания биосенсоров), и в других областях биологии. Отличие синтетической биологии скорее в том, что это междисциплинарное направление, объединяющее несколько крупных проектов, таких как создание вычислительных устройств на основе живых систем или создание организмов с дизайнерскими геномами, синтезированными .
Как это делается
Синтез ДНК в лаборатории сам по себе не является сложной задачей — методики, позволяющие построить цепочку с заданной последовательностью нуклеотидов, были разработаны еще в 80-х годах XX века. Однако ситуация в области синтетической геномики с методической точки зрения напоминает ситуацию с секвенированием в начале проекта по расшифровке генома человека — технологии уже есть, но еще крайне непроизводительные. В результате, чтобы синтезировать даже самый короткий геном, придется опираться на схему «маленькие кусочки — кусочки побольше — большие куски — целая молекула».
Наиболее популярный и дешевый амидофосфитный метод синтеза ДНК-цепочек на твердофазном носителе позволяет провести не более 100-200 циклов последовательного присоединения нуклеотидов, причем вероятность ошибочного присоединения с каждым циклом увеличивается. Таким образом, на выходе можно получить короткие одноцепочечные молекулы ДНК (олигонуклеотиды), состоящие максимум из 200 звеньев. Альтернативой этому методу может стать ферментативный синтез с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT). Этот фермент работает как ДНК-полимераза, удлиняя цепочку за счет присоединения новых нуклеотидов, но для синтеза ему не нужна матрица. Ферментативный подход может увеличить точность синтеза, но, судя по всему, не длину готового продукта. Пока что максимальная длина цепочки, полученной таким образом, составила 150 нуклеотидов. Кроме того, для коммерческого использования технология пока недоступна. Несмотря на ограничение по длине, такая продуктивность синтеза до недавних пор устраивала большинство пользователей. Короткие цепочки ДНК используются во множестве биологических приложений — в качестве затравок для полимеразной цепной реакции, в качестве зондов для детекции последовательностей, подавления экспрессии генов и мутагенеза. Тем не менее, появление синтетической биологии привело к росту конкуренции на рынке синтеза, в результате чего цены заметно упали. Заказать синтез целого гена длиной в несколько сотен или тысяч нуклеотидов теперь может позволить себе большинство исследовательских лабораторий.
Чтобы синтезировать даже единственный ген, на старте придется иметь дело с большим количеством коротких олигонуклеотидов. На этапе дизайна эксперимента последовательность ДНК разбивают так, чтобы последовательности этих олигонуклеотидов перекрывались друг с другом. Дальше олигонуклеотиды смешивают по несколько штук и объединяют при помощи полимеразной цепной реакции. Этот метод тоже был изобретен еще в конце 80-х и так сильно подстегнул развитие молекулярной биологии, что за его разработку вручили Нобелевскую премию.
В реакции, состоящей из множества циклов последовательного разделения и отжига цепочек друг на друга, используется термостабильная ДНК-полимераза, которая достраивает вторую цепь ДНК на одноцепочечной матрице. В результате короткие перекрывающиеся кусочки можно не только сшить друг с другом, но и многократно копировать.
Далее куски ДНК объединяют в большие фрагменты путем ферментативной сборки, или, что проще, с использованием в качестве «швеи» клетки пекарских дрожжей. За счет усиленной способности к рекомбинации ДНК дрожжи могут объединить друг с другом много перекрывающихся последовательностей. Именно таким способом был собран геном «синтетической микоплазмы», причем дрожжи смогли соединить одновременно 25 кусков ДНК.
Большие фрагменты генома кишечной палочки были собраны таким же образом. Однако для создания промежуточных форм хромосомы пришлось полагаться на рекомбинацию в клетках самой бактерии. Обычно небольшие фрагменты ДНК несложно встроить в бактериальный геном, однако для встройки кусков ДНК размером по 100 тысяч пар оснований пришлось применять метод на основе CRISPR с внесением двуцепочечных разрывов.
Что синтезируется
С большой вероятностью читатели слышали об экспериментах с геномами микоплазмы, которые проводит команда Вентера, — например, о создании бактерии с минимальным геномом мы писали в 2016 году.
Микоплазмы — самые маленькие и просто устроенные бактерии с маленькой кольцевой хромосомой. Именно геном размером 582970 пар оснований стал первым проектом по синтезу ДНК живых организмов. Его результаты были опубликованы в 2008 году, а в 2010-м ученые из института Вентера сообщили в статье в , что вдвое больший геном был не только синтезирован, но и внедрен в клетку и стал реплицироваться, что дало авторам основание говорить о «первом синтетическом живом организме».
Тем не менее, точкой отсчета в синтетической геномике принято считать не эксперименты Вентера, а эксперименты с геномами вирусов (по традиции, вирусы живыми организмами не считаются, так как не способны к воспроизводству вне клетки-хозяина).
В 2002 году была опубликована статья о синтезе ДНК, соответствующей РНК-содержащему геному полиовируса типа 1 (возбудителя полиомиелита). Размер ДНК-прототипа вирусного генома составил всего 7500 пар оснований, но на тот момент это был самый большой ДНК-фрагмент, созданный исключительно средствами биохимии. Синтетический геном содержал 27 нуклеотидных замен в качестве генетических маркеров, или опознавательных знаков.
За полиовирусом последовал геном вируса гриппа, который синтезировали в 2005 году. Исследователи сначала по крупицам воссоздали последовательность генома вируса, который в 1918-1919 годах вызвал эпидемию «испанки». Сделано это было при помощи обратной транскрипции с коротких обрывков РНК, выделенных из сохранившихся тканей жертв. Затем последовательность ДНК-копии генома вируса воссоздали в лаборатории в составе безопасной кольцевой молекулы (плазмиды). Впоследствии отдельные гены этого штамма ученые использовали в лабораторных моделях для анализа причин смертоносности этой разновидности вируса.
Промежуточный рекорд по размеру синтезированного генома (точнее, опять же, его ДНК-копии) был поставлен в 2008 году, когда ученые, пытаясь разобраться в причинах вспышки атипичной пневмонии, получили в лаборатории последовательность генов размером почти 30 тысяч пар оснований коронавируса SARS из летучей мыши.
Однако уже в том же году вышла статья Дэниела Гибсона о синтезе генома микоплазмы в полмиллиона пар. Описанные в статье новые методы сборки последовательностей были взяты на вооружение другими исследователями, так что с тех пор получение маленьких вирусных геномов перестало быть выдающимся достижением. Даже удивительно, что после «испанки» и SARS относительно недавняя статья о воссоздании вымершего вируса лошадиной оспы вызвала такой широкий резонанс и обеспокоенность общественности.
Итак, первым живым организмом с дизайнерским геномом стала микоплазма. Еще до стадии синтеза в последовательность ее генома при планировании эксперимента были введены замены, позволяющие не просто оставить опознавательные знаки, но и закодировать новую информацию, например электронный адрес сотрудника института. Однако микоплазма — в перспективе объект не слишком полезный. Куда важнее было разработать методологию для синтеза генома кишечной палочки.
Pacific Northwest National Laboratory